VYŠETŘENÍ PŘÍTOMNOSTI NUKLEOVÉ KYSELINY VYSOCE RIZIKOVÝCH TYPŮ HPV V CERVIKÁLNÍM STĚRU

Průběh výkonu

1. 1

   Zahájení

   Převzetím materiálu ve formě cervikálního stěru odebraného do speciálního transportního média od gynekologa v jeho ordinaci a transportem ve speciálních přenosných krabicích do laboratoře. Je kontrolován počet, označení průvodky, stav po převzetí. Materiál je označen nezaměnitelným identifikačním kódem, zapsán a uložen do doby provedení analýzy.

2. 2

   Průběh

   Jedno stanovení zahrnuje zpracování 8 kontrol a průměrně 15 vzorků. (Alternativní metoda automatické detekce pomocí automatického izolátoru nukleových kyselin zahrnuje zpracování 2 kontrol a průměrně 15 vzorků. Vzorky v odběrové zkumavce jsou v automatu x480 smíchány v reagenční plotně s roztoky PK SDS, přeneseny do třepacího ohřívacího bloku a tam inkubovány. Následně automat přidává MGP (magnetické skleněné částice) a lyzační roztok. Reagenční plotnu transportuje do magnetického separátoru, kde se odstraní lyzační roztok a následuje dvounásobné promytí promývacím roztokem. Odsávaná přebytečná tekutina je odváděna do hermeticky uzavřené nádoby. Reagenční plotna je přenesena do procesního stojánku a přidá se eluční pufr. Pak se reagenční plotna vrátí do třepacího ohřívacího bloku, kde probíhá eluce za současného zahřívání a třepání. Poté je reagenční plotna přenesena zpátky do magnetického separátoru, kde se oddělí eluát od skleněných magnetických částic a napipetuje se do MWP plotny. Mezitím automat připraví pracovní master mix smícháním MMX a metalických iontů. Ten následně přidá k eluátu v MWP a MWP přenese do startovní pozice, čímž je proces izolace nukleové kyseliny ukončen a směs eluátu a master mixu je připravena na zahájení amplifikace a detekce. Obsluha analyzátoru musí do 90 minut přenést MWP obsahující eluát smíchaný s pracovním master mixem do analyzátoru z480. Po vložení MWP do z480 se automaticky nastartuje RT PCR, po jejíž ukončení software automaticky vyhodnotí výsledky (přítomnost HR HPV, HPV 16 a HPV18), které lze vytisknout anebo exportovat do LIS.) Alternativní metoda detekující mRNA HR HPV využívá cílené izolace specifické mRNA pomocí záchytných oligomerů, které se navazují na magnetické mikročástice. Mikročástice, včetně zachycených cílových molekul HPV mRNA, které jsou na ně navázané, jsou zataženy ke straně reakční zkumavky pomocí magnetů a supernatant se odsaje. Částice se promyjí, aby se odstranila reziduální matrice vzorku, která může obsahovat inhibitory amplifikace. Po dokončení zachycení cíle je HPV mRNA amplifikována pomocí transkripčně zprostředkované amplifikace. Detekce amplikonu je dosaženo pomocí metody hybridizační ochrany využívající jednořetězcové sondy nukleové kyseliny s chemiluminiscenčním označením, které jsou komplementární k amplikonu. Značené sondy nukleové kyseliny hybridizují specificky s amplikonem. Selekční reagencie rozlišuje hybridizovanou od nehybridizované sondy deaktivací značení nehybridizované sondy. Během detekčního kroku je světlo vyzařované z označených hybridů RNA:DNA měřeno jako fotonové signály v luminometru a intenzita je hlášena jako relativní světelné jednotky (RLU).

3. 3

   Ukončení

   Na základě analýzy výsledků poskytnutých speciálním softwarem kvalifikovaný pracovník vydá vyjádření či zápis, ve kterém uvede, zda je v analyzovaných vzorcích pomocí použité metody detekována HR HPV NA a případně o jaký typ se jedná. Zjištěný nález je zapsán do výsledkové listiny, zanesen do dokumentačního systému laboratoře a výsledková listina je předána k odeslání požadujícímu lékaři. Vzorky jsou archivovány v mrazicím boxu po určenou dobu k případné opakované analýze. Nálezy a výkony jsou evidovány na elektronickém médiu.