KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HIV-1 VIROVÉ NÁLOŽE POMOCÍ REAL-TIME PCR (POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE V REÁLNÉM ČASE)

Průběh výkonu

1. 1

   Zahájení

   Příjmem a zpracováním biologického materiálu (nesrážlivá krev odebraná do EDTA) od HIV infikovaného či AIDS nemocného pacienta.

2. 2

   Průběh

   Z nesrážlivé venózní krve HIV infikovaného pacienta se odstředěním oddělí plazma, která se uloží při -80 st. C až do zpracování. Virové částice HIV-1 obsažené v 0,5 ml rozmražené plazmy se rozloží inkubací při teplotě 50 st. C v přítomnosti dezintegračního roztoku obsahujícího kromě jiného proteázu a chaotropní činidlo. Zároveň s dezintegračním roztokem se do každého vzorku přidá známý počet molekul RNA kvantifikačního standardu. Následně se do dezintegrační směsi přidá izopropanol a směs se odstředí v kolonce s vložkou ze skelných vláken. Během odstřeďování se RNA naváže na povrch vložky ze skelných vláken, zatímco soli, bílkoviny a jiné buněčné nečistoty se odstředěním odstraní. Po opakovaném promytí se adsorbované nukleové kyseliny vymyjí vodným roztokem. V další kroku se k 50 \mikro l izolované RNA přidá 50 \mikro l reakční směsi obsahující kromě jiného enzym s aktivitou reverzní transkriptázy a DNA polymerázy a reakce se inkubuje v termocykleru po dobu přibližně 3,5 hodiny. Během inkubace se RNA přepíše do komplementární DNA (reverzní transkripce) a v polymerázové řetězové reakci (Real Time PCR) se namnoží úsek HIV-1 genu gag. V každém cyklu Real Time PCR je množství DNA molekul automaticky detekováno prostřednictvím duálně fluorescenčně značených oligonukleotidových sond, které umožňují specifickou detekci amplifikovaného HIV-1 vzorku a amplifikovaného kvantifikačního standardu (technologie PCR v reálném čase). Pro HIV-1 vzorek i pro kvantifikační standard jsou zaznamenána čísla cyklů, ve kterých fluorescence signalizačního barviva sondy přesáhne nastavený fluorescenční práh a je vypočítán titr kvantifikačního standardu a HIV-1 vzorku. Výsledky jsou vyjádřeny kvantitativně v počtu kopií HIV-1 RNA / ml plazmy.

3. 3

   Ukončení

   Interpretací výsledků a odesláním výsledkového protokolu.