STANOVENÍ GENOTYPU HIV-1 PRO ZJIŠŤOVÁNÍ REZISTENCE K ANTIRETROVIROVÝM INHIBITORŮM S CÍLEM SLEDOVÁNÍ EFEKTIVITY ANTIRETROVIROVÉ TERAPIE (ART)

Průběh výkonu

1. 1

   Zahájení

   Příjmem a zpracováním biologického materiálu (nesrážlivá krev do EDTA) od HIV infikovaného (či AIDS nemocného) pacienta.

2. 2

   Průběh

   Z nesrážlivé venózní krve HIV infikovaného pacienta se odstředěním oddělí plazma, která se uloží při -80 st. C až do zpracování. Pro zakoncentrování HIV-1 virových částic se 0,5 ml rozmražené plazmy centrifuguje jednu hodinu při 4 st. C. Po odstranění supernatantu jsou virové částice v peletu rozloženy působením chaotropního činidla (guanidin thiocyanát). Virová RNA se vysráží izopropanolem a centrifugací se koncentruje do peletu, který se omyje 70% etanolem. Po vysušení se virová RNA rozpustí ve dodném roztoku. Před reverzní transkripcí se 10 \mikro l izolované HIV-1 genomové RNA zahřeje na 65 st. C, aby se uvolnila sekundární struktura RNA. Poté se k RNA přidá 10 ul reakční směsi obsahující kromě jiného reverzní transkriptázu a reakce se inkubuje v termocykleru 60 minut při 42 st. C, přičemž vzniká komplementární DNA (cDNA). Poté se reverzní transkriptáza inaktivuje pětiminutovým zahřátím na 95 st. C a reakce se ochladí na 4 st. C. Po reverzní transkripci se do zkumavky obsahující cDNA přidá 30 \mikro l reakční směsi obsahující kromě jiného Taq DNA polymerázu a vzorek se inkubuje v termocykleru po dobu přibližně 4,5 hodiny. V průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) se namnoží 1,8 kb úsek HIV-1 genu pol, který zahrnuje celý gen pro proteázu a větší část genu pro reverzní transkriptázu. Po PCR se vzorek přečistí na kolonkách Microcon YM-100, které propustí nízkomolekulární zbytky PCR reakční směsi a zachytí velké namnožené molekuly DNA. 5 ul přečištěného PCr produktu se spolu se standardem elektroforeticky analyzuje v 1% agarózovém gelu obsahujícím ethidium bromid. Porovnáním fluorescence DNA vzorku se standardem o známé koncentraci se semikvantitativně určí koncentrace DNA vzorku a vzorek se naředí na koncentraci optimální pro sekvenační reakce. K 8 ul ředěné DNA se přidá 12 \mikro l sekvenační reakční směsi obsahující kromě jiného fluorescenčně značené dideoxy terminátory a reakce se přibližně 2,5 hodiny inkubují v termocykleru, kde probíhá cyklické sekvenování. Pro každý vzorek se připravuje celkem sedm reakcí se sedmi různými primery, kterými se osekvenuje 1,3 kb úsek zahrnující celý gen pro HIV-1 proteázu a prvních 335 kodónů pro HIV-1 reverzní transkriptázu. Fluorescenčně značené sekvenční fragmenty se vysráží etanolem s octanem sodným a centrifugací se koncentrují do peletu, který se omyje 70% etanolem. Po vysušení se rozpustí ve formamicu. Rozpuštěné vzorky se denaturují 2 minuty při 95 st. C a poté se analyzují v automatickém kapilárním sekvenátoru. Data ze všech sedmi reakcí se zkombinují do jediné konsenzuální sekvence, která zahrnuje celý gen pro HIV-1 proteázu a prvních 335 kodónů pro HIV-1 reverzní transkriptázu. Tato konsenzuální sekvence se porovná s odpovídající sekvencí referenčního kmene HXB2 a naleznou se případné rozdíly - mutace. Mutace se kontrolují při manuální editaci konsenzuální sekvence. Ze zjištěných mutací se rezistence k jednotlivým inhibitorům reverzní transkriptázy a proteázy určí s využitím několika obecně uznávaných algoritmů (např. ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software, Stanford University HIVdb Program, International AIDS Society - USA HIV Drug Resistance Mutations Figures and Use Notes).

3. 3

   Ukončení

   Interpretací výsledků a odesláním výsledkového protokolu.